Desarrollo y aplicacion de PCR multiple para la deteccion simultanea de tres virus de ADN en camote (Ipomoea batatas L.)

El virus colusivo del camote (SPCV, genero Cavemovirus), el virus del aclaramiento de venas del camote (SPVC, genero Solendovirus) y el virus del enrollamiento de hojas del camote (SPLCV, genero Begomovirus) son virus con genoma de ADN, presentes en el camote en infecciones virales simples o multliples. La identificacion y deteccion de estos virus es complicada, ya que con frecuencia son asintomaticos y estan en concentraciones bajas en las plantas de camote. Se desarrollo una PCR multiple (mPCR) con el objetivo de lograr la deteccion simultanea de SPVC, SPVCV y SPLCV (y Begomovirus relacionados); para ellos se seleccionaron cebadores especificos para SPCV y SPVCV, y se utilizaron cebadores degenerados para Begomovirus (desarrollados por Li et al. 2004). Para la optimizacion de parametros se usaron plantas de camote con infecciones simples y mixtas. Se optimizo la concentracion de cebadores (0,1-0, 3uM), MgCl2 (2,5-8,0mM), dNTPs (0.2-0.8 mM), Taq-polimerasa (2-4U), parametros en el termociclador (temperatura de hibridacion de 48-62 oC y el numero de ciclos de 29-35), y la cantidad de acidos nucleidos (50-300 ng). Para validar le mPCR se uso plantas de camote de una coleccion de germplasma in vitro que estaban infectados con los virus en estudio y fueron confirmados por clonacion y secuenciamiento de las amplificaciones obtenidas. Los pares de cebadores especificos seleccionados para cada virus pudieron amplificar fragmentos de ADN en tamanos esperados, a una concentracion final de 0.16 uM para cebadores de SPCV y SPVCV, y 0.2uM para SPLCV. Ademas la concentracion de ADN adecuada esta entre 50-100 ng, con 30 ciclos termicos y 53 oC de temperatura de hibridacion. Este ensayo demostro ser simple, sensible y confiable para el diagnostico de rutina de SPCV, SPVCV y SPLCV (y Begomovirus relacionados). El ensayo de mPCR sera util para programas de cuarentena, como un metodos rapido y rentable para un gran numero de muestras.

Citation: Berrocal, A.; Rossel, G.; Fuentes, S.; Perez, A.; Cuellar, W.; Kreuze, J. 2013. Desarrollo y aplicacion de PCR multiple para la deteccion simultanea de tres virus de ADN en camote (Ipomoea batatas L.) In: Asociacion Peruana de Fitopatologia (APF). Libro de Resumenes. 22. Congreso Peruano de Fitopatologia. 17 Congreso Latinoamericano de Fitopatologia (CPLAF - 2013). Lambayeque (Peru). 1-5 Oct 2013. Lima (Peru). APF. p. 73.
2015-03-11
DNA, pcr, PLANT DISEASES, PLANT VIRUSES, SWEET POTATOES
BIODIVERSITY FOR THE FUTURE, GENEBANK

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